LAMP-CRISPR技术，新型POCT产品开发利器！（poct研发）

成功管理传染病和流行病的首要任务是快速准确地检测病原体，新冠就是一个最好的例子，并且POC检测的重要作用和需求也在疫情中凸显出来。

根据世卫组织给出了关于POC检测的ASSURED标准：价格合理（Affordability）、灵敏度（Sensitivity）、特异性（Specificity）、易操作（User-friendly）、快速可靠（Robust）、便携性（Equipment-free）及即时性（Deliverable）。

但是其实，要开发出符合所有这些标准的病原体特异性POC检测还是有难度的。因此，利用现有技术的结合一直是近些年体外诊断企业的重点努力方向。

其中最具有突破性并已有结果的一个技术就是结合了等温扩增的CRISPR技术，满足了ASSURED标准，是开发新一代POC诊断的理想方法。

本文将重点总结基于LAMP的CRISPR技术，围绕以下几个方面分享：

1）LAMP和CRISPR技术

2）为什么选择LAMP与CRISPR技术结合

3）LAMP-CRISPR技术在POC平台上应用

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LAMP

LAMP环介导等温扩增是在2000年由日本荣研化学株式会社纳富继宣博士发明的一种简单、快速、准确、便宜的新型基因扩增方法，随后被用于各种人体、动物和农业的病原体检测。尤其是在新冠疫情期间，随着许多改良的LAMP方法应用于检测SARS-CoV-2病毒，LAMP技术已进入了黄金时期。

该技术主要特点是用到4-6个识别目标DNA 特定区域的引物。扩增反应首先由具有链置换活性的Bst酶和两个特别设计的引物引发形成环状结构，引起随后几轮扩增后产生大量的DNA。通常来说，1 – 10个DNA拷贝可在15-60分钟内扩增获得 10^9 – 10^10 拷贝的DNA产物，是灵敏度和特异性都很高的扩增方法。

LAMP反应操作简便，不需要像qPCR一样经过不同温度循环，可以在60-65°C恒温下扩增，其反应结果可以通过浊度法、荧光法和探针法进行观察。

迈迪安生物Meridian，赞14

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CRISPR

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，基于成簇间隔短回文重复序列 )作为一种基于RNA的后天免疫防御系统，其间隔序列与噬菌体或质粒序列存在同源性，能利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白靶向几乎所有生物和细胞中遗传错误的基因。

CRISPR/Cas系统由靶向外源基因组材料特定区域的引导RNA序列（gRNA）和效应Cas（CRISPR相关核酸酶）蛋白组成。

CRISPR/Cas系统是一种非常独特且极具前景的技术，可用于基因编辑和分子诊断，能够通过编程gRNA序列靶向任何基因区域，其在传染病检测中最重要的作用是通过使用Cas蛋白识别病原体和基于核酸的诊断。

CRISPR/Cas技术在核酸检测中的使用需要前置扩增或后置扩增。通过将CRISPR/Cas技术与PCR或等温扩增，如LAMP、RPA、NASBA和RCA等方法相结合，开发了新一代的分子诊断方法，可以高灵敏度和特异性检测DNA和RNA。

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LAMP-CRISPR

基于LAMP的CRISPR技术是近年来研发出用于病原体检测的新一代分子诊断技术，这种技术的结合应用消除它们单独使用时存在的限制。

比如说，LAMP虽然有快速扩增的优势，但是很容易出现假阳性的问题。不正确的引物设计、受污染的DNA和未优化的反应体系（如缓冲液pH值、Mg浓度、具有干扰作用的染料）可能导致检测的特异性和灵敏度降低。

而CRISPR/Cas技术使用reporter来检测特异性靶标，可以消除LAMP的局限性，降低假阳性结果的可能，实现高灵敏度和高特异的检测。

结合LAMP的CRISPR/Cas技术可以通过荧光层析纸条或直接肉眼判断检测结果，不需要像其他核酸检测一样进行定量测量，实现高效、灵敏、特异且不需要复杂设备的POC检测。

LAMP-CRISPR/Cas技术已被用于检测各种传染性病毒和细菌（表1）。在许多检测中，这种技术对病原体检测中显示出高达100%的特异性和灵敏度。与金标准qPCR相比，LAMP-CRISPR检测周转时间更短，非常适合用于快速检测。

表1 各种LAMP-CRISPR/Cas应用平台比较

尽管如此,LAMP-CRISPR/Cas也是具有一些局限性的，主要源于这项技术需要两个步骤，即扩增过程和CRISPR/Cas过程。这两个过程具有不同的化学成分和反应条件。LAMP扩增中使用的Bst酶反应温度在60-65度，而CRISPR反应的Cas酶在37度左右，整个反应需要两个不同的温度。使用两种不同的反应过程和反应体系可能会增加污染风险。

目前，也有解决办法可以克服这个局限性，比如说，在HOLMESv2检测中，通过使用嗜热Cas12b（从嗜酸芽孢杆菌中分离）实现单管反应，解决不同反应温度的问题。

也有的为了最大限度地降低对操作人员的技术需求和污染风险，通过在反应试管底部用油密封LAMP试剂，把CRISPR试剂反应管盖上来实现单管反应。LAMP扩增后，将试管倒置混合启动CRISPR/Cas12a过程。

CRISPR/Cas技术也可以与PCR和其他等温方法相结合，如NASBA、RCA和RPA,但是都具有一定局限性。

比如说由于需要用于热循环的复杂设备，PCR在POC诊断平台中不是优选的。

与LAMP类似，其他等温扩增方法也不需要复杂的设备，不过它们通常需要两个引物、两种或多种酶。例如，NASBA需要使用三种酶来扩增RNA或单链DNA，此外与其他方法相比，CRISPR和NASBA组合的灵敏度较低。相比之下，LAMP技术通过使用单一的Bst酶成本和操作复杂性更低。并且LAMP通过使用多个引物提供了更高的特异性和更高的效率。

RPA虽然用的也较多，不过RPA需要最后一步将扩增产物转化为RNA分子，因此，它经常与Cas13酶结合使用,它最主要的优势是RPA反应的温度跟CRISPR反应温度接近，但是最大局限性是和CRISPR扩增的产物浓度较低。它在靶标浓度低的时候灵敏度不如LAMP好。当使用CRISPR组合LAMP时，可以获得高浓度的扩增产物。因此，LAMP优于其他等温方法更被优于选择与CRISPR技术结合使用在POC诊断平台中。

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LAMP-CRISPR在POC中的应用

受LAMP技术在POC平台中的启发，LAMP-CRISPR POC设备通常依赖于三个阶段的实验过程：

（1）DNA/RNA提取

（2）LAMP扩增

（3）CRISPR/Cas反应

在单管中实现这三个步骤可最大限度地提高用户便利性，目前已有几种POC平台取得了成功。基本原理是将LAMP和CRISPR/Cas反应集成在微流控芯片上进行，然后通过荧光检测或者测流层析读取结果。

例如一个便携式POC仪器采用可充电半自动设备，尺寸只有3.5cmX3cmX13cm大小，可用于移动实验室、机场和检疫区。它有个可改变温度的按钮，以确保RT-LAMP扩增在65℃和CRISPR/Cas12a在37℃进行。一次可在35分钟内检测10个样品，然后通过层析试纸通过肉眼检测结果。

还有新西兰DNAiTECH公司采用的微流控芯片将LAMP和CRISPR集成一体，设备是由低功率电阻加热元件组成，直接加热纸基材或管中的液体等分，以保持LAMP和CRISPR反应需要的温度，反应产物最终集成在纸上。通过蓝色LED灯照亮纸张激发反应产物的荧光基团，然后使用智能手机摄像头和数据分析app捕捉和量化反应产生的信号。这是目前第一家单纯基于纸质监测的LAMP-CRISPR/Cas POC平台。

总体来说，开发LAMP-CRISPR/Cas的POC检测，简化样本处理和核酸裂解步骤，实现全过程的自动化，对提高样本周转时间和使用便捷度是关键。

迈迪安为LAMP-CRISPR POCT开发

提供的解决方案

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其主要优势包括：

➣ 快速、特异的LAMP预混液配方 （TTR更提前，NTC延迟）

▸ DNA检测

▸ RNA检测

➣ 为不同样本类型优化的LAMP预混液配方

（血液、尿液、唾液、粪便…）

▸ 免核酸提取直接快速扩增

▸ 对提取的核酸中存在的抑制物残留有更高耐受性

➣ 可兼容冻干的LAMP预混液配方

➣ 可兼容各种POC仪器的配方

▸ 不同形式，不同浓度

▸ 可定制，可冻干

➣ 商业大规模生产（预混液，单组分酶…）

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总结

新冠疫情推动了各种先进的分子诊断技术的发展，同时对于便于使用的POC检测需求也越来越高，需要能快速、可靠、高效、灵敏和特异地给出检测结果，这也是新检测技术或者是集成现有的技术以开发更好的诊断方法的驱动力。

LAMP和CRISPR/Cas的结合就是最好的例子，其可以提供快速、高特异性和高灵敏的POC诊断。从这个意义上说，它符合所有的期望。当然，由于结合了两种技术，其复杂性和限制性依然存在。

迈迪安作为全球领先的上游原料企业，用优质可靠的分子产品推动新一代诊断技术的发展，助力LAMP-CRIPSR技术用于更多POC平台的开发。

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Meridian BioScience（以下简称：迈迪安）是一家全球领先的生物诊断公司，总部设立在美国，距今已有45年的历史。迈迪安公司分为诊断和生命科学两个部分，在中国地区的主营业务是生命科学产品，包括各种分子和免疫诊断检测的关键原料，如抗原抗体、免疫阻断剂、PCR和LAMP反应的聚合酶和优化的预混液、核苷酸等，为人体、动物、农业、环境及食品安全等各种检测提供全面的解决方案。45年来，迈迪安已经成为全球各领域诊断企业的首选原料供应商！